烟叶中烟草特有亚硝胺(TSNA)的研究进展
2005-09-11来源：烟草市场作者：刘万峰 王元英
人类吸烟已有近千年的历史，至今全世界吸烟人口有近13亿。吸烟与健康问题已日益引起人们的关注。早在20世纪50年代初英国皇家医学会就公开提出吸烟有害健康，50年代末，美国卫生署和英国皇家医学会都发表公告认为吸烟过量是产生肺癌的病因之一。从此，从未间断过的小规模的反吸烟运动开始演变为世界范围的禁烟浪潮。进入20世纪90年代，禁烟呼声日益高涨，世界烟草业的发展已到了势关存亡的关键时期。为了自身的生存发展和对人类的健康负责，各国都积极对吸烟与健康问题开展了广泛的研究。烟叶和烟气中的一些有害成分，特别是有致癌性的烟草特有亚硝胺(TSNA)，更加引起各国科学家们的极大关注。近年来对烟草特有亚硝胺(TSNA)的研究已取得了长足进步，其致病机理已得到初步阐明，对其分析的仪器、方法也愈加精确可靠。但是同时也应该清醒地看到，一些关键性的问题依然尚未解决，TSNA的形成机理还未彻底阐明，很多过程仅限于猜测和可能。而人们最关心的如何最大限度降低烟草中TSNA的含量问题，至今仍没有圆满的答案。对育种家们来说，如何通过遗传改良途径降低烟叶中TSNA含量，从而获得低TSNA含量的烟草品种已成为亟待解决的关键性问题。
1 烟草特有亚硝胺(TSNA)的发现
烟草特有亚硝胺——TSNA(Tobacco-Specific Nitrosamines)的研究最早始于20世纪60年代初，据报道，目前已鉴定出了8种烟草特有的亚硝胺。其中的4种：N´-亚硝基降烟碱(NNN)，N´-亚硝基新烟碱(NAT)，N´-亚硝基假木贼碱(NAB)和4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)研究得最为深入。在这4种TSNA中，NNN是发现最早的一个，并且在1977年报道了烤烟品Coker139中的NNN的平均含量为1.31mg/kg。以后又发现4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁(NNK)、N´-亚硝基新烟碱(NAT)、N´-亚硝基假木贼碱(NAB)作为烟草特有的亚硝胺同样在烟草及烟草制品中存在。N´-亚硝基新烟碱(NAT)在烟草中的存在则最先是由Hoffmann等人在1979年的。1983年，Adams对卷烟中的NNK进行了定量研究。1987年在烟草鼻烟中又发现了另一种烟草特有亚硝胺4-(N-甲基-N-亚硝胺基)-4-(3-吡啶基)-1-丁醇的存在，但是，它在别的类型烟草和烟草制品中是否存在，还缺少证据。烟草中的TSNA含量极微，一般浓度均在0.001～10mg/kg，在这几种烟草特有的亚硝胺中，NAB的含量最小，约为NAT含量的10%。
2 TSNA的形成
烟草特有亚硝胺的形成过程至今尚未完全明确。目前普遍认为TSNA在鲜烟叶中很少或几乎不产生，其形成与积累是在采收后产生的，而且大部分是产生于调制期间。
烟叶中的烟碱与TSNA有密切关系。烟碱的代谢与降解可产生次生代谢产物，主要是去甲基烟碱，其次是可替宁和假氧化烟碱。其中去甲基烟碱和假氧化烟碱都是生成NNN和NNK的中间产物。在亚硝酸盐存在情况下，去甲基烟碱生成N´-亚硝基去甲基烟碱(NNN)，新烟碱生成N´-亚硝基新烟碱(NAT)，假木贼碱生成N´-亚硝基假木贼碱(NAB)。叔胺烟碱反应很慢，最后生成4-(N-亚硝基胺)-4-(3-吡啶基)-1-丁醛(NNA)和4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)以及N´-亚硝基去甲基烟碱(NNN)。综上所述，关于烟草特有亚硝胺的形成途径应该有两条：一条是烟草生物碱在微生物的作用下发生亚硝化作用生成TSNA；一条是硝酸盐在微生物的作用下生成亚硝酸盐，这些亚硝酸盐和其它氮氧化物再与烟草生物碱反应生成TSNA。
3 烟草特有亚硝胺的危害
1962年，国际上首次在科技文献中有文章报道烟草中含有亚硝胺及其有潜在的致癌作用。目前，有关TSNA的致病机制在国内外已有大量报道，但很多都是在动物试验中得到证实，在人体中是否有同样作用还有待研究。NNN特别是NNK是强烈的动物致癌剂，它会对小鼠、大鼠及叙利亚金田鼠诱发肺癌。仅将1μgNNK一次注入田鼠中即可造成肺部癌瘤的高发病率。生化研究表明，在新陈代谢活动中，NNK使动物活体和离体的人体组织中的DNA甲基化，从各种人体组织中分离出7-甲基鸟嘌呤及06-甲基鸟嘌呤中可以得到证明。分子生物学家认为遗传密码中带06-甲基鸟嘌呤的DNA是一种化学损害，有可能引起肿瘤。
另外还发现：当给小鼠喂饲高脂肪食物时，NNK能诱导环加氧酶-2活性增强，而环加氧酶-2活性过量表达则意味着许多疾病的发生，其中包括癌变。
4 烟叶中TSNA分析检测的方法
由于TSNA在烟草中的含量极微，一般浓度均在0.001～10mg/kg，而且每一种TSNA的含量也不相同，其中NNN，NAT和NNK的含量相对较大；而NAB含量则更加微少，几乎无法进行准确定量分析，其含量通常是和NAT一起被报道的。1975年开始用高效液相色谱仪与质谱仪联机的方法对烟草的NNN进行定量分析，取得了预期的效果。同年，热能分析仪问世，它的出现较好地解决了极微量的各类TSNA的检测问题。使用热能分析仪与气相色谱仪或高效液相色谱仪联用对烟草特有亚硝胺进行分析具有其它方法不可替代的作用。因为热能分析仪作为气相色谱仪或高效液相色谱仪的检测器具有相当高的灵敏度，可以检测到烟草中0.001mg/kg浓度的亚硝胺。但是热能分析仪价格昂贵且专用性很强，一般实验室很难配备，这样便限制了它的应用。1986年，运用GC/MS在选择离子扫描模式下对烟草和烟气中的NNN和NNK进行分析，也取得了一定效果。近年来有人采用气相色谱仪配备氮-磷检测器来测定烟草中的特有亚硝胺也取得了较好的效果，但是检测的结果不如配用热能分析仪的精确度高，含量极微的NAB不易被检测出。
5 影响烟叶中TSNA累积的因素
5.1 不同类型烟草烟叶中的TSNA
烟草基因型对TSNA积累的影响一直是研究的主题之一。不同类型的烟叶中所含的TSNA的量不同，而且各种形式的TSNA在每种烟草烟叶中所占的比例也不同。在晾烟中，NNN和NAT的含量高于NNK和NAB的含量。烤烟中占主要地位的TSNA是NNK，白肋烟中的为NNN。
Burton等人研究了烤烟G-28、白肋烟KY14及深色晾烟KY171中的TSNA含量。结果显示：晾制的烤烟型烟叶中无论是在叶片还是在叶脉中，其TSNA水平都比白肋烟和深色晾烟的水平低。S.V.Bbide等人对N.rustica和N.tabacum研究时发现：在其它条件一致的情况下，N.rustica中的NNN浓度比N.tabacum中NNN浓度高几倍。已有的研究表明：在相同的栽培和调制条件下，不同类型烟草中TSNA的含量差异显著，存在着种属特异性。据Inyer W等人报道，烤烟中的TSNA的含量比深色晾烟和白肋烟中的都低。而O.T.Chortyk等的研究显示：调制后的烤烟叶片中的NNK含量比晾制的白肋烟叶片中的高出10倍。
5.2 不同调制过程和方法对TSNA累积的影响
不同的调制方法对烟叶中TSNA水平的影响是很明显的。有人曾做过这样的实验：将烤烟G-28收获后进行烘烤和晾制，结果，G-28晾制时产生的TSNA总量比烘烤时的高2.5倍，晾制的主脉中TSNA的含量远远高于烘烤的主脉。
1999年，David M.Peele等人研究烤烟调制方法时发现，改变烘烤形式，将直接烘烤变为热交换式烘烤，可以将TSNA总量与NNK含量分别降低91%和93%。有试验显示：①晒晾烟单纯晾制；②晾制至叶片变棕色时快速干燥；③晾制变黄后，加热到30～40℃加速棕色化反应最后快速干燥。3种方法得到结果：①TSNA含量最低；②中等；③TSNA含量最高。
由此可见，调制的方法不同，调制过程中控制的条件不同，产生的TSNA是很不相同的。
5.3 硝酸盐和亚硝酸盐与TSNA
烟草中限制亚硝胺累积的另一因素是硝酸盐。早在1983年就有报道：烟叶和卷烟烟气中的硝酸盐与TSNA含量有明显相关。1989年又报道烟草中的硝酸盐和TSNA之间有显著相关。但现在普遍认为，亚硝酸盐才是TSNA最直接的中间体，然而亚硝酸盐不在烟株中积累(测不出或只有痕量存在)，烟草中只有硝酸盐，它是亚硝酸盐的前体。亚硝酸盐是在调制期间通过酶和微生物作用将硝酸盐还原而形成。不同类型、不同品种的烟草其硝酸盐含量不同，酶活性和微生物作用也不完全相同，这样，产生的亚硝酸盐的量不同，最终形成的TSNA的量也就不同。
在烟株的不同部位，亚硝酸盐在底部叶片含量高，上部叶片含量最低，而TSNA的分布情况几乎完全与亚硝酸盐一样。烟株底部高浓度的亚硝酸盐可能部分地归于高浓度的硝酸盐，另一种可能性是硝酸盐导致了亚硝酸盐的累积。但是不管怎样，硝酸盐、亚硝酸盐、TSNA之间有一种关系是很可能存在的：高浓度的硝酸盐→高浓度的亚硝酸盐→高浓度的TSNA。
5.4 微生物与TSNA
烟叶中的TSNA基本都是在采收后的调制过程中产生的。其中，微生物对TSNA形成的影响非常显著，在TSNA的两条形成途径中都有微生物在起调节作用。不同的调制方法和调制时控制的条件不同而产生不同的TSNA，其主要原因之一就是微生物的作用不同。为了研究微生物群对TSNA累积的影响，人们做了下列试验：将栽培品种VA403和KY160的叶片分为收获期叶片；变黄期叶片；收获后10d叶片；收获后17d叶片。每部分叶片在调制前都分别用乙醇、利福平、链霉素和水浸湿后晾干，结果发现：利福平和链霉素处理过的叶片的微生物群数大大减少，亚硝酸盐含量降低，TSNA的累积减少；而与此相反，用水处理过的叶片(特别是变黄期叶片)微生物群数增加，亚硝酸盐含量增加，同时叶片中的TSNA的量也是最高的。
表1 各种类型烟草中的TSNA含量
|
样品 |
NNN/μg·g-1 |
NAT/μg·g-1 |
NNK/μg·g-1 |
|
烤烟烟梗 |
nd |
0.19 |
nd |
|
马里兰烟梗 |
2.85 |
0.50 |
0.98 |
|
下部烤烟 |
0.62 |
1.12 |
1.23 |
|
上部烤烟 |
1.26 |
1.46 |
1.66 |
|
下部白肋烟 |
6.30 |
3.17 |
0.50 |
|
中部白肋烟 |
4.80 |
2.49 |
0.70 |
|
上部白肋烟 |
7.35 |
4.22 |
0.68 |
|
香料烟 |
0.12 |
0.18 |
0.02 |
6 降低烟叶中烟草特有亚硝胺的可能途径
烟叶作为一种工业原料，需要进行调制加工后才能应用于工业生产。同时它又是一种农产品，许多性状指标不可避免地要受到农艺方面的影响。烟叶中的TSNA几乎都产生于调制期间，但其自身性状对TSNA形成的影响也是非常明显的。因此，降低烟叶中的TSNA需要从工业和农业两方面着手。
6.1 适量施肥氮控制烟叶中硝酸盐含量
控制氮肥施用量，可减少烟叶中的TSNA。这是因为N是烟碱合成的必须元素，控制氮肥可降低烟叶中的烟碱的含量，从而降低TSNA。Inyer Wahlberg等人采用KY171，TR-Madole和M-609三个品种，对不同施氮肥量进行了评价，结果表明：高施氮肥量烟草的硝酸盐和尼古丁含量比低施氮肥量的高，而且TSNA的含量在高施氮肥量的情况下始终是高的。这可能是在高施氮肥量下，TSNA的直接(生物碱)和间接(硝酸盐)前身物的浓度较高致使TSNA的含量升高。
6.2 通过遗传改良选育低TSNA含量的烟草品种
目前，通过遗传途径降低烟叶中TSNA含量已成为烟草研究领域的一大热点。虽然鲜烟叶中检测不到TSNA的存在，但是调制后的不同类型的烟叶中TSNA含量的差异却非常显著。众多试验证明：烟草不同基因型与尼古丁、TSNA含量显著相关。这就为通过遗传改良选育低TSNA含量的品种提供了重要的理论基础。
运用传统的育种方法，将不同类型、不同品种的烟草在相同的栽培条件下种植，收获后采用相同的调制方法调制，然后分析各品种的TSNA含量，找出低TSNA含量的品种，进一步分析出TSNA的遗传特性。通过用其它性状优异但产生的TSNA含量高的品种与产生的TSNA含量低的品种杂交，以期望获得低TSNA含量且其它性状同样优良的品种。
不同类型烟草产生的TSNA的量不同，这本身是因为存在着遗传上的差异，这种差异是由内部的基因所决定的，因此可以运用现代分子生物学技术进行品种改良。目前的各种分子标记技术，如RAPD技术、RFLP技术、AFLP技术、SSR技术等等，都可以使烟草不同的生态型或不同的近交系的DNA产生多态性，表现出物种特异性，从而构建出特异的DNA遗传图谱和物理图谱，并进一步找出控制TSNA积累的有关目的基因。这样，就可以在基因水平上进行操作，避免工作中的重复和盲目性。
6.3 适当的调制方式可以大量降低烟叶中的TSNA
烟叶中的TSNA几乎都是在调制过程中产生的，因此选用适当的调制方式，控制调制过程中的反应条件对降低TSNA含量是非常重要的。
烤房主要分为直燃式烤房和热交换式烤房，目前我国的烤房(除少数引进的燃气烤霸外)都是热交换式烤房。直燃式烤房由于燃料燃烧产生的热气体中含有NOx类氮氧化物，它们随燃烧产生的热气体进入烤房后，能与烟草生物碱反应生成TSNA，使烟叶中的TSNA含量增加。而热交换式烤房燃烧产生的热气体不与烟叶接触，因而应用热交换式烤房烘烤的烟叶中TSNA含量较低。
微生物在TSNA的形成中起着重要作用，在调制过程中改变微生物活性和数量，也必然会影响TSNA的累积。研究证明：调制期叶片表面的湿度与微生物活性在一定范围内呈线性关系，叶表相对湿度小，微生物活性低，产生的亚硝酸盐和TSNA的量少。因此，调制时适当降低空气和叶表湿度将有利于降低烤后烟叶中的TSNA的量。另外，也有试验证明，调制前用利福平、链霉素等药物处理过的叶片，其表面的微生物群数减少，调制后TSNA含量降低。
在硝酸盐和生物碱生成TSNA的系列反应中，亚硝化酶起着决定性的作用。也有人提出设想：通过化学或生化手段将亚硝化酶选择性地杀死，或使其活性降低乃至丧失，阻断TSNA的形成途径，从而可以极大地降低烟叶中的TSNA含量。但这一方法操作起来有相当大的难度，是否可行还有待进一步研究。
来源：中国烟草市场摘自《中国烟草科学》作者：刘万峰 王元英
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